HPLC液相色譜常見問題及故障排除

第一章、簡要說明及一些必要的提示

當(dāng)您遇到問題時(shí)，我們需要先判斷問題出在什么地方，最好的方法就是排除法，在其他條件不變的情況下，改變其中一個(gè)條件，如果問題依然沒有改變，則問題不是出在改變了條件的部分，然后再一個(gè)一個(gè)改變其他條件，直到找出可以影響問題結(jié)果的所有條件為止。

接下來，再看看這些對(duì)結(jié)果有影響的條件，有哪些條件是可以做適當(dāng)調(diào)整的，然后再慢慢調(diào)整，直到得到滿意的結(jié)果為止。

如果以上方法不能得到滿意的結(jié)果，您就可能需要完全的更換某些條件，比如更換色譜柱，更換保護(hù)柱，更換接頭，更換溶劑等等。

本手冊(cè)將從四個(gè)方面列出一些液相色譜中常見的問題，并對(duì)可能的原因一一分析，最后給出解決方法。這四個(gè)方面如下：

? 1.壓力異常

? 2.漏液

? 3.譜圖問題

? 4.進(jìn)樣閥問題

預(yù)防措施

許多液相色譜的故障是可以通過日常維護(hù)避免的，例如：定期的更換柱塞桿密封可 以避免柱塞密封的磨損以及由此產(chǎn)生的相關(guān)的故障。第六章列出了很多液相色譜的常見故障以及預(yù)防措施及建議。您需要針對(duì)您的色譜儀器類型靈活調(diào)整這些建議并使之成為實(shí)驗(yàn)室日常維護(hù)工作的一部份。

第二章、常見問題之壓力異常

操作壓力的變化往往是故障的征兆，從下列原因中找出最接近的現(xiàn)象，并在右側(cè)的 列表中找出相應(yīng)的解決方法。

• 沒有壓力顯示，沒有流動(dòng)相流動(dòng)??????????????????????????????????表1

 

原因	解決辦法
電源問題	接通電源、開機(jī)
保險(xiǎn)絲被燒壞	更換保險(xiǎn)絲
控制器設(shè)定不正確或設(shè)定失敗	a. 采取恰當(dāng)?shù)脑O(shè)定b. 修理或更換控制器
柱塞桿折斷	更換柱塞桿
泵頭內(nèi)有空氣	溶劑脫氣、啟動(dòng)泵抽出空氣
流動(dòng)相不足	a. 補(bǔ)充流動(dòng)相b. ? 更換入口篩板
單向閥損壞	更換單向閥
漏液	擰緊或更換手緊接頭

?

• 流動(dòng)相流動(dòng)正常，但沒有壓力顯示????????????????????????????????表2

 

原因	解決方法
儀表損壞	更換儀表
壓力傳感器損壞	更換壓力傳感器

?

C、壓力持續(xù)偏高??????????????????????????????????????????????????表3

原因	解決方法
流速設(shè)定過高	調(diào)整流速設(shè)定
柱前篩板堵塞	a. 在允許情況下反沖色譜柱b. 更換篩板* c. 更換色譜柱
流動(dòng)相使用不當(dāng)或緩沖鹽的結(jié)晶沉淀	a．使用恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相b．沖洗色譜柱
色譜柱選擇不當(dāng)	選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱
進(jìn)樣閥堵塞	清洗或更換進(jìn)樣閥
柱溫過低	提高溫度
控制器失常	修理或更換控制器
保護(hù)柱阻塞	清洗或更換保護(hù)柱
在線過濾器阻塞	清洗或更換在線過濾器

 

D、壓力持續(xù)偏低??????????????????????????????????????????????????表4

原因	解決方法
流速設(shè)定過低	調(diào)整流速
系統(tǒng)漏液	確定漏液位置并維修
色譜柱選擇不當(dāng)	選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱
柱溫過高	降低溫度
控制器失常	維修或更換控制器

 

E、壓力不斷上升

原因	解決方法
見表3	見表3

 

F、壓力降為零

原因	解決方法
見表1和2	見表1和2

 

G、壓力不斷下降，但不回零

原因	解決方法
見表4	見表4

 

H、壓力波動(dòng)

原因	解決方法
泵中有氣體	a. 溶劑脫氣b. 從泵中除去氣體
單向閥損壞	更換單向閥
泵密封損壞	更換泵密封
脫氣不充分	a. 溶劑脫氣b. 改脫氣方法(使用在線脫氣法等)
系統(tǒng)漏液	確定漏液位置并維修
使用梯度洗脫	由于流動(dòng)相粘度的變化引起的壓力波動(dòng)是正常的

 

第三章、常見問題之漏液

通常漏液問題可以靠擰緊或更換管路接頭來解決，但值得注意的是過度擰緊會(huì)導(dǎo)致 金屬接頭的漏液和塑料接頭的磨損。如果通過稍微擰緊接頭不能解決漏液，就必須 將接頭取下，檢查是否損壞(例如：卡套損壞、密封表面有雜質(zhì))；損壞的接頭應(yīng)該更換掉。

A、接頭處漏液

原因	解決方法
接頭松動(dòng)	擰緊
接頭磨損	更換
接頭過緊	a.?????? 擰松，再重新擰緊b.????? 更換接頭
接頭被污染	a. 拆下清洗b. 更換接頭
部件不匹配	使用同一品牌的配件

 

B、泵漏液

 

原因	解決方法
單向閥松動(dòng)	a. 擰緊單向閥(不必?cái)Q得過緊)b. 更換單向閥
接頭松動(dòng)	擰緊接頭(不必?cái)Q得過緊)
混合器密封損壞	a. 更換混合器密封b. 更換混合器
泵密封損壞	維修或更換泵密封件
壓力傳感器損壞	維修或更換壓力傳感器
脈沖阻尼器損壞	更換脈沖阻尼器
比例閥損壞	a. 檢查隔膜，如果漏液立即更換b. 檢查手緊接頭，如果損壞立即更換
放空閥損壞	a. 擰緊放空閥b. 更換放空閥

 

C、進(jìn)樣閥漏液

原因	解決方法
轉(zhuǎn)子密封損壞	重新安裝或更換進(jìn)樣閥
定量環(huán)阻塞	更換定量環(huán)
進(jìn)樣口密封松動(dòng)	調(diào)整
進(jìn)樣針頭尺寸不合適	使用恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣針
廢液管阻塞	更換廢液管
廢液管中產(chǎn)生虹吸	保持廢液管高于廢液液面

 

D、色譜柱漏液

原因	解決方法
尾端接頭松動(dòng)	擰緊接頭
卡套內(nèi)有填料	拆下、清洗卡套、重新安裝
篩板厚度不合適	使用合適的篩板(參考下表)

篩板選擇指南

填料粒徑	篩板孔徑
2-4um	0.5um
5-20um	2um

 

E、檢測器漏液

原因	解決方法
流通池墊片損壞	a. 避免過大的背壓b. 更換墊片
流通池窗破碎	更換窗片
手緊接頭漏液	擰緊或更換
廢液管阻塞	更換廢液管
流通池阻塞	重新安裝或更換

 

第四章、常見問題之譜圖問題

液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來，其中有一些問題可以通過改變?cè)O(shè) 備參數(shù)得到解決，而其它問題必須通過修改方法來解決問題。選擇正確色譜柱和流 動(dòng)相是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。

A、峰拖尾

原因	解決方法
篩板阻塞	a. 反沖色譜柱b. 更換進(jìn)樣口篩板 c. 更換色譜柱
色譜柱塌陷	填充色譜柱/更換色譜柱
干擾峰	a. 使用更長的色譜柱b. 改變流動(dòng)相/或更換色譜柱
流動(dòng)相pH選擇錯(cuò)誤	調(diào)整pH值，對(duì)于堿性化合物的分離，低pH值可使峰形更對(duì)稱
樣品與填料的活性位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)	a.?????? 加入離子對(duì)試劑或揮發(fā)性堿性改性劑 b. 更改色譜柱

 

B、峰前延

原因	解決方法
柱溫低	升高柱溫
樣品溶劑選擇不恰當(dāng)	使用流動(dòng)相作為樣品溶劑
樣品過載	降低樣品含量
色譜柱損壞	反沖或更換色譜柱

 

C、峰裂分

 

原因	解決方法
保護(hù)柱或分析柱進(jìn)樣口污染	取下保護(hù)柱再分析：若有需要，應(yīng)更換保護(hù)柱 若是分析柱進(jìn)樣口堵塞，拆下來清洗。 如果分析柱阻塞，可以反沖色譜柱。 如果問題仍然存在，可能是色譜柱被強(qiáng) 保留物質(zhì)污染，可運(yùn)行適當(dāng)?shù)脑偕?/p> 施。如果仍不能解決問題，可能是進(jìn)樣 口堵塞，可以更換篩板或色譜柱。
樣品溶劑不溶于流動(dòng)相	改變樣品溶劑。如果可能，使用流動(dòng)相為樣品溶劑。

 

D、大峰變形

原因	解決方法
樣品過載	減少進(jìn)樣量

 

E、較早洗脫峰變形

原因	解決方法
樣品溶劑選擇不恰當(dāng)	a. 減少進(jìn)樣體積b. 用更弱的溶劑

 

F、較早洗脫出的峰拖尾程度大于較晚洗脫出的峰

原因	解決方法
柱外效應(yīng)	a.??????? 調(diào)整系統(tǒng)連(使用更短、內(nèi)徑更小的管路) b. 使用小體積的流通池

 

G、容量因子(k’)增加時(shí)，拖尾更嚴(yán)重

原因	解決方法
二級(jí)保留效應(yīng)，反相模式	a.?????? 加入三乙胺(堿性樣品)b.????? 加入乙酸(酸性樣品) c.?????? 加入鹽或緩沖劑(離子型樣品) d.????? 更換色譜柱
二級(jí)保留效應(yīng)，正相模式	a.?????? 加入三乙胺(堿性樣品)b.????? 加入乙酸(酸性樣品) c.?????? 加入水（多官能團(tuán)化合物），僅適 用于使用水溶性流動(dòng)相的正相方法 d. 試用另一種液相色譜方法
二級(jí)保留效應(yīng)，離子對(duì)	加入三乙胺(堿性樣品)

 

H、酸性或堿性化合物的峰拖尾

原因	解決方法
緩沖液不合適	a.?????? 使用濃度50-100mM的緩沖液b.????? 使用與流動(dòng)相pH值相等pKa的緩 沖液

 

I、額外的峰

原因	解決方法
樣品中有其他化合物	正常
前一次進(jìn)樣未洗脫出的峰	a.?????? 增加運(yùn)行時(shí)間或梯度斜率b.????? 提高流速
空缺或鬼峰（購買專門的鬼峰消除小柱，解決鬼峰問題）點(diǎn)擊這里獲取鬼峰柱信息	a.?????? 檢查流動(dòng)相是否純凈b.????? 使用流動(dòng)相作為樣品溶劑 c.?????? 減少進(jìn)樣體積
污染	過濾樣品

 

J、保留時(shí)間改變（保留時(shí)間在5%左右波動(dòng)一般被視為正常）

原因	解決方法
溫控不當(dāng)	維持柱溫不變
流動(dòng)相變化	防止變化(蒸發(fā)、反應(yīng)等)
色譜柱平衡不充分	在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱

 

K、保留時(shí)間突然變化

原因	解決方法
流速變化	重新設(shè)定流速
泵中有氣泡	從泵中除去氣泡
流動(dòng)相選擇不恰當(dāng)	a.?????? 更換合適的流動(dòng)相b.????? 檢查流動(dòng)相混合器

 

L?、基線漂移

原因	解決方法
柱溫波動(dòng)(即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差折光檢測器、電導(dǎo)檢測器或較高靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)	控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器
流動(dòng)相不均一(基線向上漂移，流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移)	使用色譜純?nèi)軇⒏呒兌鹊柠}和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用過程中用氦氣
流通池被污染或有氣體	用甲醇或其他強(qiáng)溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸清洗 (不要用鹽酸)
檢測器出口阻塞(高壓造成流通池窗破裂，產(chǎn)生基線噪音)	清理阻塞物或更換管路。參考檢測器手冊(cè)更換流通池窗
流動(dòng)相配比不當(dāng)或變動(dòng)流速	調(diào)整配比或流速。為避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速
柱平衡慢，特別是更換流動(dòng)相時(shí)	用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，在分析前用10-20倍柱體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗
流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由劣質(zhì)溶劑配成	檢查流動(dòng)相的組成。使用優(yōu)質(zhì)化學(xué)試劑及色譜純?nèi)軇?/td>
樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高k’ 值) 以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高基線(梯度分析會(huì)使其加劇)	使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子
循環(huán)使用流動(dòng)相，但檢測器未調(diào)整	重新設(shè)定基線。如循環(huán)流動(dòng)相已超出檢測器檢測范圍，使用新的流動(dòng)相
檢測器(UV)沒有設(shè)定在最大吸收波長處	將波長調(diào)整至最大吸收波長處

 

M、基線噪音(規(guī)則的)

原因	解決方法
在流動(dòng)相、檢測器或泵中有空氣	流動(dòng)相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣
漏液	見第三章。檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封
流動(dòng)相混合不完全	用人工配置流動(dòng)相或使用低粘度的溶劑
溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)	減少差異或使用熱交換器
在同一條線上有其他電子設(shè)備	斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自外部，加以更正
泵脈沖	在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器

 

N、基線噪音(不規(guī)則的)

原因	解決方法
漏液	見第三章。檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。 檢查檢測器流通池是否漏液
流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由劣質(zhì)溶劑配成	檢查流動(dòng)相的組成
流動(dòng)相溶劑不互溶	選擇互溶的流動(dòng)相
檢測器/記錄儀電子元件問題	斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正
系統(tǒng)內(nèi)有氣泡	用強(qiáng)溶劑沖洗系統(tǒng)
檢測器內(nèi)有氣泡	沖洗檢測器，在檢測器后面安裝背壓調(diào)節(jié)器
流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音)	用1N的硝酸(不能用鹽酸)清洗流通池
檢測器燈能不足	更換氘燈
色譜柱硅膠或填料流失	更換色譜柱
流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常	維修或更換混合器，在使用等度模式時(shí)，建議離線流動(dòng)相配制

 

O、寬峰

原因	解決方法
變動(dòng)流動(dòng)相組成	重新配制流動(dòng)相
流動(dòng)相流速太低	調(diào)節(jié)流速
漏液(特別是在柱子和檢測器之間)	見第三章，檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液、是否有鹽析出和不正常的噪音。如果必要，更換密封
檢測器設(shè)定不正確	調(diào)整設(shè)定
柱外效應(yīng)a.?????? 柱子過載 b.????? 檢測器響應(yīng)時(shí)間過長或流通池體積過大 c.?????? 柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大 d.????? 記錄儀響應(yīng)時(shí)間太長	a.?????? 減少上樣量(如10μL vs. 100μL) 或1:10和1:100稀釋樣品b.????? 減少響應(yīng)時(shí)間或使用更小的流通池 c.?????? 使用內(nèi)徑為0.005 – 0.007英寸的較短管路 d.????? 減少響應(yīng)時(shí)間
緩沖液濃度太低	增加濃度
保護(hù)柱污染或失效	更換保護(hù)柱
色譜柱污染或失效，塔板數(shù)較低	更換同樣類型的色譜柱
柱入口塌陷	更換柱子
洗脫出的峰含有兩個(gè)或多個(gè)未被完全分離的化合物	選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果
柱溫過低	提高柱溫。除非色譜柱制造商注明，否則溫度不宜超過60°C
檢測器時(shí)間常數(shù)太大	使用較小的時(shí)間常數(shù)

 

P、分離度低

原因	解決方法
流動(dòng)相污染或變質(zhì)(引起保留時(shí)間變化)	重新配制流動(dòng)相
保護(hù)柱或分析柱阻塞	取下保護(hù)柱再分析，如需要可更換保護(hù)柱，若是分析柱堵塞，可反沖色譜柱，如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物污染，可運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?，若還不行，可能是入口處堵塞，可以更換篩板或色譜柱

 

Q、所有的峰面積都太小

原因	解決方法
檢測器衰減設(shè)定過高	降低衰減設(shè)定
檢測器時(shí)間常數(shù)設(shè)定太大	設(shè)定較小的時(shí)間常數(shù)
進(jìn)樣量過低	a.?????? 增加樣品濃度b.????? 如果柱規(guī)格允許，增大進(jìn)樣量
記錄儀連接不當(dāng)	正確連接記錄儀

 

R、所有的峰面積都太大

原因	解決方法
檢測器衰減設(shè)定過低	提高衰減設(shè)定
進(jìn)樣量過高	a.?????? 降低樣品濃度b.????? 減少進(jìn)樣量，使用更小的樣品定量環(huán)或部分定量環(huán)進(jìn)樣
記錄儀連接不當(dāng)	正確連接記錄儀

 

第五章、進(jìn)樣閥的問題

以下問題在使用進(jìn)樣閥過程中有可能產(chǎn)生。

進(jìn)樣閥漏液問題及其解決方法已經(jīng)在第三章介紹過。

A、手動(dòng)進(jìn)樣閥，轉(zhuǎn)動(dòng)不靈

原因	解決方法
轉(zhuǎn)子密封損壞	更換或調(diào)整轉(zhuǎn)子密封
轉(zhuǎn)子太緊	調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度

 

B、手動(dòng)進(jìn)樣閥，進(jìn)樣困難

原因	解決方法
進(jìn)樣閥安裝不當(dāng)	重新安裝
定量環(huán)阻塞	更換定量環(huán)
進(jìn)樣針污染	清洗或更換進(jìn)樣針
管路阻塞	清洗或更換管路

 

C、自動(dòng)進(jìn)樣閥，不能轉(zhuǎn)動(dòng)

原因	解決方法
無氣壓(或電源)	提供恰當(dāng)?shù)膲毫?電源)
轉(zhuǎn)子太緊	調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度
進(jìn)樣閥安裝不當(dāng)	重新安裝

 

D、自動(dòng)進(jìn)樣閥，其它問題

原因	解決方法
阻塞	清洗或更換阻塞部件
機(jī)械故障	見隨機(jī)維修手冊(cè)
控制器故障	維修或更換控制器

 

第六章、常見故障及日常預(yù)防維護(hù)

下表中列出了液相色譜操作中常見的一些問題，右側(cè)中則列出日常維護(hù)的方法以減 少問題出現(xiàn)的頻率。 儀器自帶的用戶手冊(cè)則提供您更多的維護(hù)方法。

A、溶劑瓶

原因	預(yù)防維護(hù)
入口過濾器阻塞	a.?????? 更換(每3-6個(gè)月)b.????? 過濾流動(dòng)相，0.5μm濾膜
氣泡	流動(dòng)相脫氣

 

B、泵

原因	預(yù)防維護(hù)
氣泡	流動(dòng)相脫氣
泵密封損壞	更換(每3個(gè)月)
單向閥損壞	過濾流動(dòng)相、使用入口過濾器，準(zhǔn)備備用單向閥

 

C、進(jìn)樣閥

原因	預(yù)防維護(hù)
轉(zhuǎn)子密封損壞	a.?????? 不要擰的過緊b.????? 過濾樣品

 

D、色譜柱

原因	預(yù)防維護(hù)
篩板阻塞	a.?????? 過濾流動(dòng)相b.????? 過濾樣品 c.?????? 使用在線過濾器或保護(hù)柱
柱頭塌陷	a.?????? 避免使用pH>8的流動(dòng)相 (針對(duì)大部分硅膠的色譜柱) b.????? 使用保護(hù)柱 c.?????? 使用預(yù)柱(飽和色譜柱)

 

E、檢測器

原因	預(yù)防維護(hù)
氘燈失效，檢測器響應(yīng)降低，噪音擴(kuò)大	更換(每6個(gè)月)或準(zhǔn)備備用燈
流通池有氣泡	a.?????? 保持流通池清潔b.????? 池后使用反壓抑制器 c.?????? 流動(dòng)相脫氣

 

特別提示：污染物會(huì)導(dǎo)致下列問題

???背壓升高

??峰裂分

??峰展寬

??基線噪音

??基線漂移

??分離度降低

??色譜柱的永久損壞

???系統(tǒng)損壞

建議使用HPLC保護(hù)柱來保護(hù)您的HPLC色譜柱和結(jié)果，點(diǎn)擊這里獲取保護(hù)柱信息。